이전 글에서는 RELION 5.0을 설치하고 Conda 환경을 구성하는 방법을 다루었습니다.
이번 글에서는 RELION의 공식 튜토리얼 흐름과 GUI 메뉴 및 입력 항목까지 최대한 동일하게 따라가며
튜토리얼 데이터를 실습해 보겠습니다.

사용하는 데이터는 RELION 공식 튜토리얼 데이터셋 (relion30_tutorial_data.tar)이며,
JEOL Cryo-ARM (200 kV) 장비에서 촬영된 β-galactosidase 샘플입니다.

1. 튜토리얼 데이터 다운로드

터미널에서 다음 명령어로 데이터를 다운로드하고 압축을 풉니다:

wget ftp://ftp.mrc-lmb.cam.ac.uk/pub/scheres/relion30_tutorial_data.tar
tar -xf relion30_tutorial_data.tar

이 작업으로 relion30_tutorial_data/Movies/ 디렉토리에 마이크로그래프 무비파일들이 위치하게 됩니다.

2. 프로젝트 설정 및 Import

원하는 폴더에서 RELION GUI를 실행한 후 다음 단계를 따라 진행합니다:

  • 초기 실행시 프로젝트가 없다고 뜨면서 확인을 요구하는 단계가 있습니다.

  • Job Type: Import

  • Movies / Micrographs (I/O tab): /Movies/*.tiff

  • Import raw micrographs? 선택 (예: Yes)

  • MTF of the detector: mtf_k2_200kV.star

  • Pixel size (Å): 0.885

  • Voltage (kV): 200

  • Spherical aberration:: 1.4

  • Amplitude contrast: 0.1

Import 작업을 실행하면 Import/job001/ 디렉토리가 생성되고, 마이크로그래프 파일들이 프로젝트에 등록됩니다.

3. Motion Correction (Frame alignment)

튜토리얼 데이터에는 이미 motion-corrected 마이크로그래프가 포함되어 있으므로, 이 단계를 생략해도 무방하지만 연습을 위해 GUI에서 설정해볼 수 있습니다:

  • Job Type: Motion correction (MotionCor2)
  • Input (I/O tab): Import/job001/movies.star (Import output)
  • Dose per frame(e/A2): 1.277
  • EER fractionation: 32
  • Write output in float16?: Yes
  • Do dose-weighting?: Yes
  • Save sum of power spectra?: Yes
  • Sum of power spectra every e/A2: 4

in Motion tab

  • Gain-reference image: Movies/gain.mrc

MPI 1, threasds 12로 실행하라고 나와있지만, 이것은 각각의 워크스테이션의 성능에 맞춰서 수정하면 됩니다. 개인용 워크스테이션의 경우 24코어를 가지고 있으므로 MPI 3, threads 4 혹은 6으로 실행합니다. 이 잡을 실행하면 MotionCorr/job002/ 디렉토리에 평균(motion-corrected) 마이크로그래프와 .star 파일이 생성됩니다.

4. CTF 추정 (CTF Estimation)

Motion correction 결과를 바탕으로 CTF 값을 계산합니다:

  • Job Type: CTF estimation (CTFFIND4)
  • Input (I/O tab): MotionCorr/job002/corrected_micrographs.star
  • Minimum resolution (Å): (Default)
  • Maximum resolution (Å): 3
  • Defocus search range: (Default) e.g. 5000–20000 Å

실행하면 CtfFind/job003/ 폴더에 .star 파일과 CTF 매개변수 정보가 포함된 출력이 저장되며, GUI에서 Thon ring 품질을 Display를 이용해 확인할 수 있습니다.

5. Auto-picking

CTF 추정이 완료된 마이크로그래프를 기반으로 자동 입자 탐지를 진행합니다:

  • Job Type: Auto-picking (LoG / Laplacian-of-Gaussian)
  • Input micrographs (I/O tab): CtfFind/job003/micrographs_ctf.star
  • Min. diameter for loG filter (A): 150
  • Max. diameter for loG filter (A): 180

오토 픽킹의 경우 마이크로그래프를 나누어서 일부분만 사용하는 것이 효과적입니다. 서브셋 셀렉션을 사용하여 적당히 마이크로그래프를 나누어서 LoG 픽킹을 사용하여 추후 토파즈 오토픽킹에 사용할 템플릿을 만듭니다.

6. Particle Extraction

자동 탐지된 좌표에 따라 입자를 추출합니다:

  • Job Type: Particle extraction
  • Input micrographs (I/O): CtfFind/job003/micrographs_ctf.star
  • Input coordinates (I/O): AutoPick/job004/particles.star
  • Box size: 256 픽셀
  • Rescaling / Downsampling: 128 픽셀 (binning)

추출된 particles.star 파일이 Extract/job005/ 폴더에 저장됩니다. 이 파일이 이후 2D Classification의 입력으로 사용됩니다.

7. 2D Classification

입자 정합성 및 품질 제어를 위해 2D 분류를 수행합니다:

  • Job Type: 2D Classification
  • Input particles (I/O): Extract/job005/particles.star
  • Number of classes (K): 50
  • Regularisation parameter T: 2
  • Number of iterations: 25
  • Initial reference: None / default

분류가 완료되면 Class2D/job006/에 클래스 평균 이미지들이 생성됩니다. GUI “Display” 창에서 클래스 이미지를 확인하고, 서브셋 셀렉션을 사용하여 좋은 클래스를 선택합니다. 이후 이 입자들을 사용하여 토파즈 픽킹을 시도할 수 있으며, 여러번의 반복을 통해 좋은 입자만을 선택하여 다음으로 넘어갑니다.

8. 초기 3D 모델 생성 (VDAM 기반 Ab-initio)

선택된 입자를 기반으로 초기 모델을 만듭니다:

  • Job Type: 3D initial model
  • Input particles: 선택된 .star 파일
  • Number of classes: 1
  • Symmetry: C1
  • Mask diameter (Å): 자동 / 지정
  • Use low-pass filter: 예 (e.g. 30 Å)

이 작업을 통해 InitialModel/job007/ 폴더에 초기 3D 맵과 관련 파일이 생성됩니다.

9. 3D 정밀 최적화 (3D Auto-refine)

초기 모델과 전체 입자를 사용하여 고해상도 3D 재구성을 수행합니다:

  • Job Type: 3D auto-refinement
  • Input: 선택된 ‘.star’ 파일
  • Mask: 자동 생성 또는 사용자 지정
  • Symmetry: D2 (튜토리얼 입자는 D2 시미트리를 가지고 있다. 시미트리가 없는 경우 C1으로 설정한다.)
  • Initial low-pass filter (A): 50

정밀 최적화가 완료되면 Refine3D/job008/ 디렉토리에 최종 run_class001.mrc 맵이 저장됩니다.

10. 후처리 (Post-processing) 및 결과 분석

  • Map sharpening / B-factor 보정 작업으로 컨트라스트 보강
  • Local resolution 계산 (예: LocalResolution job)
  • CTF refinement / 고차 수차 보정
  • Map visualization: ChimeraX 등을 이용해 출력 맵 확인
chimerax Refine3D/job008/run_class001.mrc
  • FSC curve 확인: postprocess.star 내부에서 0.143 컷오프 지점 확인
  • 클래스 선택 / 서브셋 추출: GUI의 Display → 클래스 선택 기능 활용

11. 마무리 및 권장 흐름 요약

공식 문서에는 이외에도 VDAM 알고리즘 기반 초기 모델, Blush Regularisation, CTF refinement, polishing, higher-order aberration 보정 등이 포함되어 있습니다.

일반적으로 릴라이온을 사용하여 프로세싱을 진행하는 경우 다음의 흐름을 따라갑니다.

  1. 마이크로그래프 임포트
  2. 모션 코렉션
  3. CTF 추정
  4. 입자 추출
  5. 2디 분류
  6. 입자 선택
  7. 4-6을 여러번 반복, 좋은 입자 추출 후 다음으로 진행
  8. 이니셜 모델 생성
  9. 3디 분류를 통해 다시 한번 입자를 정제
  10. 3디 리파인
  11. 마스크 생성
  12. 포스트 프로세싱

여기까지가 일반적으로 진행되는 흐름이며, 이후 좀 더 높은 분해능을 얻기 위해서 CTF refinement, polishing 등의 작업을 수행합니다.

릴라이온의 공식 튜토리얼을 꼭 확인하시길 추천드립니다.

다음 글에서는 크라이오스파크에 대해서 조금 더 자세히 알아보겠습니다.